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Sysmex XE-5000
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Sysmex XE-5000

Systembeschreibung

XE-5000

Der XE-5000 ist ein hämatologisches Analysensystem, das mehrere Messtechnologien nutzt wie die Impedanz-, Hochfrequenz-, Fluoreszenz- und Lichtstreuungmessung. Darüber hinaus wird Technologie ergänzt durch spezifische Fluoreszenzfarbstoffe und selektive Detergentien.

Die Analysenergebnisse des Systems werden nicht nur in Form von Zahlenwerten, sondern auch als Scatter- bzw. Histogramme ausgegeben.

  • Durchsatz: ca. 150 Proben/Std.
  • Benötigtes Blutvolumen:
    • Automatischer Modus: 200 µl
    • Manueller Modus: 130 µl
    • Mit einer 1:5-Vorverdünnung: 130 µl der verdünnten Lösung

Mit Hilfe der hydrodynamischen Fokussierung, einem die Zellen zylindrisch umhüllenden Mantelstrom, erzeugt durch das Reagenz cellsheath, wird gewährleistet, dass alle Zellen die Messöffnung zentriert und einzeln passieren. Dieses Verfahren verhindert Störsignale, die durch Doppeldurchtritte (Koinzidenzen) oder Rezirkulationen entstehen könnten. Somit wird auch bei extremen Zellkonzentrationen ein genaues Zählergebnis gewährleistet. Gleichzeitig wird durch die hydrodynamischen Fokussierung die Messöffnung permanent gespült, womit Verstopfungen minimiert werden können.

Das optische System des XE-5000 ermöglicht die simultane Erfassung der Vorwärts-, Seitwärtsstreuung sowie des Fluoreszenzsignals der fokussierten durch das System strömenden Einzelzellen. Verwendet wird dabei ein Halbleiterlaser (Wellenlänge: 633 nm), der die Zellen bestrahlt. Dabei liefert die Vorwärtsstreuung eine Information zur Größe der Zelle, die Seitwärtsstreuung über die Zellstruktur und die das Fluoreszenz-Signal über den Gehalt an Nukleinsäuren.

Der XE-5000 verfügt über folgende Messkanäle:

Bei Anforderung eines "Kleinen Blutbilds" wird nur Erythrozyten-Thrombozyten-Kanal sowie der DIFF-Kanal benutzt. Beim "Differentialblutbild" hingegen alle mit Ausnahme des Retikulozyten-Kanals. Die Retikulozyten-Messung muss immer gesondert angefordert werden.

Sysmex Analysen-Straße

Der Sysmex XE-5000 wird sowohl als Stand-alone-Gerät (z.B. für die Analytik pädiatrischen Proben) als auch in eine Analysenstraße integriert eingesetzt. Damit erleichtigt sich die Bedienung des Systems erheblich. Außerdem können die XE-5000-Module mit einem Austreich-Färbeautomaten(SP-1000i) verbunden werden, der volautomatisch Bluttaustriche herstellt und anfärbt.

SP-1000i

  • Vollautomatische Ausstrichherstellung in hoher Qualität
  • Durchsatz von 120 Proben pro Std.
  • Selektive Anforderung der Ausstriche
  • Barcode-gestützte Probenidentifikation
  • Etikettierung der Blutaustrichspräparate

Die Messprinzipien

Der Erythrozyten-Thrombozyten-Kanal

Erythrozyten und Thrombozyten werden gemeinsam in einem Kanal gemessen, weil sie wegen ihrer deutlichen Größenunterschiede eindeutig getrennt voneinander erfasst werden können. Das Blut wird zusammen mit Verdünnungsreagenz in einer Mischkammer verdünnt. Ein fest definiertes Volumen dieser Verdünnung wird in die Messkammer eingespritzt und durch eine Kapillaröffnung gesaugt. Wenn Zellen durch diese Messöffnung treten, erzeugen sie eine elektrische Widerstandsänderung, die als elektrischer Impuls gemessen wird. Dabei ist die Größe jedes analysierten Impulses direkt proportional zur jeweiligen Größe der Zelle, die die Messöffnung in dem Moment passiert und den Impuls ausgelöst hat. Das Gerät misst darüber hinaus die Anzahl der Impulsänderungen eines fest definierten Probenvolumens in einer vorgegebenen Zeit

Die Zellverteilungen der Erythrozyten und Thrombozyten werden in zwei unterschiedlichen Histogrammen dargestellt.

Im Erythrozyten-Thrombozytenkanal-Kanal wird aus der Summe aller Erythrozyten-Einzelimpulse auch der Hämatokrit ermittelt. Die Messmethode dafür heißt "kumulative Impulshöhensummierung". Die Erythrozytenindizes MCV, MCH und MCHC werden aus den Parametern RBC, Hämatokrit und Hämoglobin berechnet.

Der Hämoglobin-Kanal

Die zur Messung der Hämoglobin-Konzentration wird die SLS-Hämoglobin-Methode eingesetzt. Wichtiger Bestandteil dieses Reagenzes ist das Sodium-Lauryl-Sulfat (SLS), ein starkesTensid, welches auch in Proteinchemie (z.B. SDS-Elekrophorese )häufig benutzt wird. Einem definierten Teil des angesaugten Blutes werden Verdünnungsmedium zugesetzt, so dass eine Verdünnung von 1:500 entsteht. SLS löst die Lipoproteine in der Zellmembran aller Zellen und setzt das Hämoglobin der Erythrozyten frei. Die hydrophoben Gruppen des SLS binden sich an den Globin-Anteil und bewirken so eine Konformitätsänderung im Hämoglobinmolekül. Dadurch wird die Oxidation des zweiwertigen Eisens möglich und es entsteht Methämoglobin. Hydrophile Bestandteile des Sodium-Lauryl-Sulfats können nun an das entstandene dreiwertige Eisen im Methämoglobinkomplex binden. Der auf diese Weise entstandene stabile Farbkomplex (SLS-Hb) ist fotometrisch quantifizierbar (Wellenlänge: 555 nm).

Die Methode ist zyanidfrei und enthält auch keine anderen toxischen Substanzen. Trübungen auf Grund von Fetten werden durch das im Reagenz enthaltene Tensid bis auf ein Minimum reduziert. Durch die in einem separaten Messkanal stattfindende Hämoglobinmessung und die Verdünnung der Probe sind die Ergebnisse auch bei einer extremen Leukozytose zuverlässig.

Der DIFF-Kanal

Im DIFF-Kanal werden die verbleibenden vier Zellpopulationen der Leukozyten bestimmt: Neutrophile, Eosinophile, Lymphozyten und Monozyten. Für die Messung wird ein Reagenziensystem bestehend aus einer Kombination von Lysereagenz und Fluoreszenzfarbstoff verwendet und mit dem Blut verdünnt. Das Lysereagenz lysiert während dieses Vorganges alle Erythrozyten und perforiert die Zellmembranen der Leukozyten. Ein Fluoreszenzfarbstoff kann somit in die Zellen eindringen. Die Leukozyten bleiben bei diesem Prozess weitestgehend intakt. Der Fluoreszenzfarbstoff färbt der Nukleinsäuren im Kern und Zytoplasma der Leukozyten an, wodurch Rückschlüsse auf die Zellaktivität und den Reifegrad möglich sind.

Nach der Inkubationszeit wird die Probe unter Verwendung des Halbleiterlasers durchflusszytometrisch analysiert. Es werden die Fluoreszenzintensität und das Seitwärtsstreulicht der Zellen gemessen. Die gemessene Fluoreszenzintensität ist proportional zum RNA- und DNA-Gehalt der Zelle und gibt Informationen über die Zellreife und Zellaktivität wieder. Die Seitwärtsstreulichtintensität ist dagegen abhängig von der Granulation der Zelle und der Größe oder Lobularität des Kerns, reflektiert also die interne Zellstruktur.

Aufgrund dieser Zellinformationen ist es möglich, die Zellsubpopulationen der Leukozyten separiert im DIFF-Kanal darzustellen: Lymphozyten (pink), Monozyten (grün), Neutrophileund Basophile (türkis) und Eosinophile (rot). Insbesondere die Granula der Eosinophilen reagiert stark mit dem Reagenz, was zu ihrem deutlich höheren Seitwärtsstreulichtsignal führt. Eosinophile können so von den anderen Zellen klar abgetrennt werden.

Darüber hinaus ist im DIFF-Kanal die Quantifizierung einer weiteren Leukozytenpopulation routinemäßig möglich. Bei Vorhandensein von Promyelozyten, Myelozyten und Metamyelozyten werden diese zusammengefasst als Parameter "IG" (Immature Granulocytes = unreife Granulozyten) gezählt.

Der Leukozyten-Basophilen-Kanal

Die Zählung der Leukozyten und basophilen Granulozyten findet im Leukozyten-Basophilen-Kanal statt. Dazu werden vom Gerät Blut und das Reagenz gemischt. Durch das Reagenz werden alle Erythrozyten in diesem Messansatz lysiert. Das saure Reagenz führt darüber hinaus zu einer Schrumpfung der Leukozyten. Nur die basophilen Granulozyten bleiben unbeeinflusst und werden stabilisiert, sodass sie in ihrer Größe und Struktur erhalten bleiben.

Bei der durchflusszytometrischen Analyse werden das Vorwärts- und das Seitwärtstreulicht gemessen. Das Vorwärtsstreulicht reflektiert die Zellgröße, während das Seitwärtsstreulicht die innere Struktur und Komplexität von Zellen wiedergibt. Durch die vorangegangene Behandlung der Zellen mit dem Reagenz entstehen zwischen Leukozyten und Basophilen sowohl ein signifikanter Größenunterschied als auch ein Unterschied in der Struktur der Zelle.

Bei der durchflusszytometrischen Analyse werden das Vorwärts- und das Seitwärtstreulicht gemessen.

Auf der Grundlage dieser beiden Eigenschaften werden die Zellen eindeutig voneinander getrennt, zuverlässig gezählt und im Leukozyten/Basophilen-Kanal-Scattergramm in separaten Populationen dargestellt.

Der IMI-Kanal

Der XE-5000 bietet in seinem IMI-Kanal (IMI = Immature Myeloid Information) die Möglichkeit, unreife Vorstufen der Granulozyten zu identifizieren und damit eine zweite unabhängige Messmethode zum DIFF-Kanal. Der IMI-Kanal ist automatisch in die Messung eines großen Blutbilds integriert.

Unreife Granulozyten haben einen geringeren Cholesterin-Gehalt als reife und die Phosphatidylcholin- im Verhältnis zur Sphingomyelin-Konzentration in der Plasmamembran-Phospholipide ist deutlich höher. Dieser Unterschied wird zur Unterscheidung zwischen dieser Zellpopulationen benutzt. Wenn die Probe mit einem speziellen Reagenz behandelt wird, kommt es zu einer Zerstörung der Plasmamembran reifer Granulozyten und in Folge zu einem Ausstrom intrazellulärer Komponenten und einem exponierten Zellkern.

Auch bei den unreifen Granulozyten wird die Plasmamembran beschädigt, bevor es jedoch zu einem Ausstrom intrazellulärer Stoffe kommt, werden durch das im Reagenz enthaltene Tensid und Schwefel-haltige Aminosäuren, die in die Zelle eindringen, die Plasmamembran und die intrazellulären Komponenten fixiert. Die Schwefel-haltigen Aminosäuren schützen die Zellen also vor der Wirkung der des Tensids. Da die verschiedenen Reifungsstufen der Granulozyten unterschiedlich auf das Reagenz reagieren, können sie getrennt voneinander dargestellt werden.

Die auf diese Weise vorbereitete Probe wird aus der Mischkammer durch einen Messwandler gesaugt und komplett ausgezählt. Dabei werden DC-(Direct-Current = Gleichstrom) und RF-Verfahren (RadioFrequency = Hochfrequenz) zur Messung benutzt.

Im Scattergramm sind die verschiedenen unreifen Leukozyten jeweils an ihren unterschiedlichen Messsignalen erkennbar.

Bei Messung einer Probe mit hauptsächlich reifen Granulozyten erscheint eine sehr homogene Population, die verhältnismäßig dicht zusammensitzt.

In Anwesenheit von unreifen Leukozyten ist das Scattergramm sehr heterogen und die Signale sind über einen großen Bereich streuen über einen weiten Bereich. Sind Thrombozyten-Aggregate vorhanden, sind zeigen sich eindeutige Veränderungen im Scattergramm.

Der Normoblasten-Kanal

Der Normoblasten-Kanal (= NRBC-Kanal) dient zur exakten Zählung der kernhaltigen erythrozytären Vorstufen. In diesem Messkanal wird eine Reagenzkombination aus Diluent und Farbstoff verwendet. Für diesen Messansatz wird die Probe mit dem Reagenz verdünnt, wobei die Erythrozyten und auch die Zellmembranen der Normoblasten durch die Reagenzeinwirkung lysiert werden. Die Zellmembranen der Leukozyten werden permeabilsiert, um den Eintritt des Fluoreszenzfarbstoffes zu ermöglichen, die Zellen selbst bleiben hingegen intakt. Der Fluoreszenzfarbstoff färbt auch in diesem Messkanal die RNA und DNA der Zellen an.

Mittels Durchflusszytometrie werden das Vorwärtstreulichtverhalten und die Fluoreszenzintensität der Zellen bestimmt. Die höchste Fluoreszenzintensität weisen hierbei die Leukozyten auf, da sowohl die RNA im Zytoplasma als auch DNA im Zellkern angefärbt werden. Von den Normoblasten werden nur die Kerne angefärbt. Diese weisen aufgrund der pyknotischen Chromatinstruktur eine geringere Fluoreszenzintensität auf. Durch diesen signifikanten Unterschied im Fluoreszenzverhalten werden die Normoblasten eindeutig von den Leukozyten getrennt.

Im Normoblasten-Kanal wird bei jeder Messung eines großen Blutbildes automatisch gemessen. Bei Vorhandensein von Normoblasten werden die Zählergebnisse der Leukozyten und Lymphozyten automatisch korrigiert. Dieses wird durch das "&"-Zeichen neben den Ergebnissen angezeigt.

Wird das Signal der Vorwärtsstreuung gegen die Fluoreszenzintensität der Partikel aufgetragen, können die Normoblasten eindeutig abgegrenzt werden, wie im Scattergramm deutlich wird.

Der Retikulozyten-Kanal

Durch Zusatz eines Lyse- und Färbe-Reagenzes kommt es zur Solubilisierung der Zellmembran und - je nach Zelltyp - zum Zellzerfall (z.B. Erythrozyten und Thrombozyten). Leukozyten werden nicht lysiert und verändern daher ihre Größe kaum, hingegen werden Normoblasten lysiert und nur der Zellkern bleibt intakt. Durch anschließende Färbung von Leukozyten mit einem Fluoreszenzfarbstoff gibt es einen zusätzlichen Parameter, die verschiedenen Zelltypen voneinander abzugrenzen. Je stärker der Nukleinsäuregehalt einer Zelle ist, desto stärker ist das Fluoreszenzsignal. Auf Grund des deutlich höheren Nukleinsäuregehalts werden kernhaltige Zellen wie Leukozyten und Erythroblasten intensiver angefärbt und klar von den Retikulozyten getrennt. Erythrozyten dagegen enthalten so gut wie gar keine Nukleinsäuren und können deswegen eindeutig von den Retikulozyten unterschieden werden. Durch Messung der Vorwärtsstreuung eines Laserlichtstrahls und der Flureszenzintensität gelingt es, damit den Retikulozytenanteil exakt zu erfassen.

Mit der Reifung der Retikulozyten nimmt der RNA-Gehalt in der Zelle kontinuierlich ab, sodass sich Retikulozyten in drei Altersstufen einteilen lassen: Die Gruppe der "reifen" Retikulozyten (= schwach fluoreszierende Retikulozyten), die Gruppe der "halbreifen" Retikulozyten (= mittelgradig fluoreszierende Retikulozyten) und die Gruppe der "unreifen" Retikulozyten (= stark fluoreszierende Retikulozyten). Gleichzeitig ermittelt der XE-5000 in diesem Messkanal, ausgehend von der Analyse der Vorwärtsstreulichtsignale der Retikulozytenpopulation, den Hämoglobingehalt dieser Zellen, ausgedrückt als Parameter RET-He.

Der Parameter PLT-O (= Thrombozyten optisch) ist eine Alternative für den Messwert, der durch eine Impedanz-Messung (Erythrozyten-Thrombozyten-Kanal) erstellt wird und hat folgende Vorteile:

  • Erhöhte Genauigkeit bei niedrigen Thrombozytenzahlen
  • Verminderte Interferenzen durch Zelldebris etc.

Der Parameter kann nur bestimmt werden, wenn eine Retikulozytenmessung erfolgt. Der Messvorgang muss daher gesondert ausgelöst werden, wenn Zweifel an der Validität der Impedanz-Messung besteht.


Warnhinweise

Blasten

Blasten erscheinen im Bereich "Blasten/Atypische Lymphozyten (= Blasts/atypical Lympho)" im DIFF-Scattergramm und im Bereich "Blasten" des IMI-Scattergramms.

Unreife Granulozyten

Im DIFF-Scattergramm erscheinen die unreifen Granulozyten im Bereich "Unreife Granulozyten (= Immature Gran)" sowie im Bereich "Unreife Granulozyten (= Immature Gran) im IMI-Scattergramm.

Linksverschiebung

Stabkernige erscheinen im Bereich "Linksverschiebung (= left-shift)" im DIFF-Scattergramm.

Atypische Lymphozyten

Atypische Lymphocyten erscheinen im Bereich "Blasten/Atypische Lymphozyten (= Blasts/atypical Lympho)" im DIFF-Scattergramm.

Normoblasten (= NRBC)

Normoblasten werden im Normoblasten-Scattergramm sowie im Bereich "Normoblasten" im DIFF-Scattergramm angezeigt.

Thrombozyten-Aggregate

Thrombozyten-Aggregate erscheinen im IMI-Scattergramm.